午夜探花

Institut f眉r Angewandte Physiologie

Funktionelle Einzelzell-Genexpressions Analyse am Beispiel dopaminerger Neuronen

 

Praktikum Laser-Mikrodissektion und Primerdesign f眉r RT-PCR Genexpressionsanalyse

(Stand: 13.07.06)

Bitte vor Praktikumsbeginn diese Unterlagen sorgf盲ltig durcharbeiten, und auch Prinzip der auffrischen (siehe auch Methodenlinks).

Dias aus der allgemeinen Einf眉hrungsvorlesung vom 19.05.06 hier als PDF.

 

1. Praktikumsziel:

 

2. Praktische Aufgaben:   

    2.1  Laser-Mikrodissection einzelner dopaminerger Neuronen aus Hirnschnitten (Maus): Im Labor AG Liss 

    2.2  PCR-Primerdesign f眉r eine RT-PCR Genexpressionsstudie (Maus): Im Computerraum der Physiologie.

3. Methoden/Techniken (Links):

    Schema zum Design einer RT-PCR Expressionsstudie:
    Infos zur Laser-Mikrodissektion: /

Maus Brain Atlas - Mittelhirnschnitt coronar, Substantia nigra

Weiterf眉hrende Links

   
   
   

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1. Praktikumsziel:

Das sowie weitere Genom-Sequenzier Projekte anderer Organismen liefern eine un眉bersichtlich grosse Menge von Gen-Informationen.
Diese Daten sind z.B. mit Hilfe des Internets aus verschiedensten Datenbasen in unterschiedlichen Formaten f眉r jedermann jederzeit abrufbar. Die Masse dieser Dienste und Datenbanken sind (noch) kostenfrei.

Im Rahmen dieses Ein-Tages Praktikums soll ein Einblick gegeben werden, auf welche Weise diese Daten im Forschungsalltag ben枚tigt und genutzt werden.
Im Speziellen soll erlernt werden, welche Datenbanken und Geninformationen zur Verf眉gung stehen, und wie die jeweils relevanten Informationen aus der F眉lle der Datenmengen extrahiert werden k枚nnen, um zB zellspezifische Genexpression mittels (Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction) zu analysieren.

Die Praktikumsteilnehmer sollen dazu in 2er/3er Gruppen selbst盲ndig nach Vorgabe ein geeignetes PCR-Primer-Set (forward/reverse) f眉r eine quantitative RT-PCR designen und am Ende des Tages Ihre Ergebnisse im Rahmen eines Kurzvortrags pr盲sentieren.

Sie werden feststellen: es sind sehr viele Informationen im Netz vorhanden, teilweise aber auch unstrukturiert und fehlerhaft, da im Prinzip jeder ungepr眉ft DNA-Sequenzen in die Datenbanken eingeben kann. Daher kann es viele verschiedene Wege geben, um die gew眉nschten Informationen f眉r ein jeweiliges Gen zu erhalten."Der Weg ist das (Praktikums-) Ziel".

Im 2. Teil des Praktikums soll die Laser-Mikrodissectionstechnik (LMD) erlernt werden, die es erlaubt, einzelne Zellen kontakfrei aus Gewebeverb盲nden (z.B. Gehirn) zu isolieren.
Es ist geplant, dass die Praktikums-Teilehmer - unter Anleitung (Ger盲t ist sehr wertvoll und empfindlich) und mit Hilfe eines - selbstst盲ndig einzelne dopaminerge Neurone in fixierten koronalen Maus-Hirnschnitten identifizieren und mittels Laser-Mikrodissektion isolieren. Die Durchf眉hrung dieses Teils h盲ngt von den zZ in unserem Labor laufenden Experimenten bzw. freien Kapazit盲ten ab.

Dar眉berhinaus werden je nach Zeit/Wunsch die Forschungsschwerpunkte der Arbeitsgruppe Molekulare Neurobiologie vorgestellt, welche mittels Einzelzell RT-PCR Genexpressionsanalyse untersucht werden.

2. Praktische Aufgaben:

Bitte f眉r die Abschlussbesprechung 眉ber die "Warum?" Fragen an den jeweiligen Stellen nachdenken, und Ihre Antworten, Probleme und individuellen L枚sungswege skizzieren.


2.1  Teil B: Laser-Mikrodissection (LMD) einzelner dopaminerger Neuronen aus Maus-Hirnschnitten:

Ziel dieses Praktikumsteils ist es, dass Sie alle mit dem Ger盲t erfolgreich einzelne dopaminerge Neurone im koronalen Hirnschnitten der Maus identifizieren, diese mittels LMD isolieren, und anschliesend die gelaserte Zelle im Reaktionsgef盲ss wiederfinden k枚nnen.

  • Bitte im Vorfeld mit der Methodik der UV-based Laser-Mikrodissektionvertraut machen: Einf眉hrungs-Dias, sowie hier: und hier . 
  • Bitte im Vorfeld mit Hilfe des Maus-Brain Atlas die Lage der dopaminergen Neuronen in koronalen Mittelhirnschnitten herausfinden: Dopaminerge Neurone finden sich beidseitig in zwei 眉berlappenden Mittelhirn-Kernen: der Substantia Nigra (SNpc - SNpr) und dem ventralen tegmentalen Areal (VTA).  
  • Relevante Maus Hirnatlas 脺bersicht hier ausdrucken  und zum Freitagstermin mitbringen (oder auch und Einf眉hrungs-Dias)
  • Dias aus der allgemeinen Einf眉hrungsvorlesung vom 19.05.06 hier.
  • Cresyl-violett gef盲rbte coronale Maus-Hirnschnitte werden von uns zur Verf眉gung gestellt.
  • Die Benutzung des Laser-Mikrodissektionsger盲ts wird vor Ort genau erkl盲rt. Bitte nur in Anwesenheit eines Betreuers daran arbeiten und im Zweifel immer Betreuer um Hilfe fragen - das Ger盲t ist sehr teuer (>100.000 EUR) und es gibt kein zweites dieser Art in Marburg...
  • Was passiert wenn man die Laserenergie erh枚ht oder erniedriegt? Was passiert, wenn man den Focus des Lasers ver盲ndert?



2.2 Teil A: PCR-Primer Design zur RT-PCR Genexpressionsanalyse f眉r Maus:

Ziel dieses Praktikumsteils ist es, dass Sie die Grundprinzipien f眉r die Auswahl von RT-PCR Primern verstanden haben, dass Sie wissen, welche Datenbanken dazu zu benutzen sind, und wie man generell mit diesen arbeitet.
Am Praktikumsende soll jede Gruppe gemeinsam das ausgew盲hlte Primerpaar f眉r Ihr Gen vorstellen bzw den Weg der Primerwahl diskutieren - auch hier gilt: der Weg ist das Ziel.

  • Gruppe 1:    vGlut2 = SLC17A6 = vesicular glutamate transporter 2.
  • Gruppe 2:    vGlut3 = SLC17A8 = vesicular glutamate transporter 3.
  • Gruppe 3:    EphA5 = Ephrin-Rezeptor subtyp A5.
  • Gruppe 4:    EphB1 = Ephrin-Rezeptor subtyp B1.

       Species: Maus = "mus musculus" f眉r alle 4 Gene bzw Gruppen .

Folgendes Schema soll Schritt f眉r Schritt (I-IV, in dieser Reihenfolge!) f眉r das jeweilige Gen ausgef眉hrt werden:
Detaillierte Infos zur Durchf眉hrung und Benutzung der jeweiligen Datenbanken/Programme finden Sie unter Punkt 3.
Bitte hier erst einmal lesen - dort sollten Sie alle Infos finden, die Sie ben枚tigen.

I. Welche Funktion hat das zu untersuchende Gen bzw das Genprodukt? Gibt es alternative Namen? (, Gencards), siehe auch Punkt 3.1
II. Auffinden der cDNA Sequenz () und der genomischen Struktur i.e. die Intron/Exon 脺berg盲nge (): siehe auch Punkt 3.2
  • Entscheidung f眉r einen NCBI Sequenz-Eintrag, da in der Regel mehrere, teils unterschiedliche Genbankeintr盲ge f眉r das selbe Gen zu finden sind.
  • Aufschreiben der individuellen NCBI "Accession number" (spezif. Identifikationsnummer f眉r jeden einzelnen Genbankeintrag, erm枚glicht auch, die Sequenz in anderen Datenbanken wiederzufinden). 
  • Speichern der Accession-Nummer spezifischen NCBI cDNA Sequenz einmal im Genbank-Format (beinhaltet Textinfo) und einmal im Fasta-Format (reine DNA Sequenz). Ausdrucken bitte nur das Genbank-Format.
  • Einzeichnen von Start- und Stopp-Codon, sowie von mindestens einem Intron/Exon 脺bergang in den Genbank NCBI cDNA Sequenz Ausdruck (warum?).
III. Gibt es weitere Gen-Familienmitglieder oder homologe Gene oder Pseudogene (Was ist das?) mit 盲hnlicher cDNA Sequenz? Infos dazu  in , Gencards - auch kann helfen.
  • Wenn ja, Multiple Sequence Alignment (MSA) der homologen (=verwandten) Gene, um 盲hnliche  DNA Bereiche zu identifizieren (Warum ist dies wichtig?).
  • F眉r das Praktikum ist es ausreichend, wenn Sie nur ein homologes Gen mit Ihrem Zielgen per MSA untersuchen, und zwar vGlut2 und vGlut3 bzw EphA5 und EphB1: die 2. dazu ben枚tigte cDNA-Sequenz bzw Accession number k枚nnen Sie sich von Ihrer jeweiligen Partnergruppe (1/2 sowie 2/3) geben lassen.
IV. Auswahl geeigneter, Gen-spezifischer PCR-Primer:
  • Einlesen der cDNA Sequenz in das Primer-Design Programm (Primer3), genaue Angaben zu den Programmeinstellungen siehe Punkt 3.3
  • Auswahl je eines geeigneter Vorw盲rts (Forward, F, sense) und R眉chw盲rts (Reverse, R, Antisense-, Gegenstrang-) Primers:
  • Das resultierende PCR Fragement soll zwischen  50-100 bp gross sein (warum?) und mind ein Exon/Intron-脺bergang beinhalten (warum?).
    • <>脺berpr眉fen der Spezifit盲t der ausgew盲hlten Primer durch Genbankabfrage ():
    Insbesondere das 3' Ende (die letzten 5 Basen) des Primers, an dem die Taq-Polymerase bindet, sollte sehr spezifisch f眉r das Zielgensein, und keine anderen Gene derselben Species (als Maus) erkennen (Warum?).
  • Auffinden/Eintragen der Primersequenzen in den NCBI cDNA Genbank-Sequenz Ausdruck: Beachte: der Reverse (R) Primer wird auch in 5' - 3' Sequenz vom Primer Programm ausgegeben, muss also in der Genbank-Sequenz reverse complement (umgekehrt und r眉ckw盲rts) gelesen/gesucht werden!
           

3. Schema zum Design einer RT-PCR Expressionsstudie:

    3.1   Informationssammlung f眉r das zu untersuchenden Gen
    3.2   Auffinden der cDNA und DNA Sequenzen (Intron-Exon)
    3.3   Auswahl eines geeigneten PCR Primerpaars f眉r eine RT-PCR Analyse

3.1 Informatiossammlung f眉r das zu untersuchende Gen
  • Auswahl des / der Gene, deren Expression untersucht werden soll (f眉rs Praktikum: Gruppeneinteilung siehe oben).
  • Was ist 眉ber die Funktion und Expression des Gens/Genprodukts bekannt? Sind assoziierte Krankheiten beschrieben?
  • Versuche, m枚glichst viele Informationen 眉ber das Gen herauszufinden: z.B. Basenl盲nge, Genvarianten, Chromosomale Lokalisation, gibt es Splicevarianten, Pseudogene, (Was ist das geanu?) homologe/verwandte Gene?

Datenbanken f眉r Gen-Info Suche:

Alle Datenbanken erfordern Keywordeingaben wie generell in Suchmaschinen zum Datenauffinden, zwei Suchworte werden mit grossgeschriebenen "AND" verbunden: z.B "Genname AND mouse"

"Online Mendelian Inheritance in Men": viel Textinfo zum Gen/Produkt, "Steckbrief", wenig DNA-Info. Idealer Startpunkt zum Einlesen.


wenig Text, viel DNA/Gen-Infos, viele Links direkt zu anderen Datenbanken teilweise, komplex zu verstehen, mann muss sich hier Zeit nehmen.


Originalliteratur/Reviews f眉r tiefergehende Infos, nicht f眉r das Praktikum relevant.


3.2 Auffinden der cDNA Sequenzen und Intron/Exon 脺berg盲nge
  • Auffinden der cDNA-Sequenz f眉r das zu untersuchende Muas-Gen mittels "": Auswahl eines individuellen Eintrags/einer Accession-Number. Diese Nummer findet sich meistens unter Punkt 3 des Genbankeintrags. Datum des Genbankeintrags: oben rechts. Entscheidungshilfe: Accession-Nummern, die mit "NM.. " anfangen sind meist die aktuellsten, die schon mehrfach 眉berpr眉ft wurden.
  • Nur mit einem spezifischen Genbankeintrag dann weiterarbeiten. (Warum wichtig?).
  • Speichern und ausdrucken der NCBI Sequenz im Format 鈥濭enbank鈥� zur Ansicht, in Format 鈥濬asta鈥� zum Bearbeiten/Einlesen in weitere Programme: Formate k枚nnen unter der NCBI Maske im "Display" 惭别苍眉punkt ge盲ndert werden.
  • Auffinden der Exon/Intron 脺berg盲nge ist am einfachsten mit dem "" Programm (s.u. link). Idealerweise f眉r die jeweilige Spezies (Maus). Sollte diese einmal nicht auffindbar sind, entsprechend verwandte Spezies nehmen 鈥� (Maus/Ratte/Human), da die 脺berg盲nge meist hochkonserviert sind (Warum?). 
  • Beachte: die Gensequenz-Eintr盲ge in NCBI und Ensemble sind nicht immer identisch. Sequenzen beginnen unterschiedlich und k枚nnen leicht unterschiedliche Sequenzen aufweisen. Zum "Wiederfinden" der Intron/Exon 脺berg盲nge hilft es daher, sich jeweils Start (ATG) und Stop Codon der Codingsequenz (CDS) anzeigen zu lassen bzw einzuzeichnen!


Datenbanken zum Auffinden von DNA Sequenzen:
 
Am besten geeignet zum Auffinden von Gen cDNA Sequenzen - individueller Accession Number:
Keyword Eingabe "cDNA AND Suchwort" f眉hrt zur cDNA (bzw genomischen DNA Sequenz) - auf Species achten!
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide


Sehr gut geeignet zum Auffinden von Intron/Exon Informationen:
Auswahl der Species (Maus), dann Keywordeingabe oder NCBI Accession number. In der "Transcript" Information/Ansicht, werden die unterschiedlichen Exone der cDNA Sequenz abwechselnd blau und schwarz dargestellt. Hilfreich und zu empfehlen: Basenpaar-Nummerierungen sowie (Start- Stop-)Codonlage und AS-Sequenz k枚nnen zus盲tzlich angezeigt werden.



Erlaubt den direkten Sequenzvergleich von 2 und mehr DNA Sequenzen:
Einkopieren der zu vergleichenden Sequenzen im "Fasta-Format" mit der 1. Kopf/Text-Zeile untereinander mit Leerzeile.W盲hle das Programm 鈥濵AP鈥� nicht 鈥濩濒耻蝉迟补濒奥鈥�.

Das Ergebnis kann mittels "Boxshade-Programm" optisch ansprechender dargestellt werden (Anleitung dazu ganz am Ende des erhaltenen MAP-Alignments. F眉r Boxshade-Output format "RTF_new" w盲hlen).



Auffinden von Homologen - 盲hnliche und verwandte Gensequenzen: F眉r das Praktikum nicht erforderlich (siehe unter 2 Punkt III)
W盲hle "Standard nucelotide-nucleotide search [blastn]". Einlesen der cDNA Sequenz: "Fasta" Format ohne die 1. Kopf/Text-zeile. Spezies kann eingeschr盲nkt werden auf "Mus Musculus" =Maus (was bewirkt dies?).


3.3 Auswahl der PCR-Primerpaare f眉r eine RT-PCR Analyse
1.  Auswahl des generell m枚glichen Gensequenz-Bereichs, in der die Primer liegen sollen:
  • Bei Genfamilien: Multiple Sequenz Alignment (MSA) der Genfamilien-Mitglieder/Splicevarianten, um homologe Bereiche zu identifizieren. Sollen genspezifische Primer gefunden werden: Primer in nicht-homologe Bereiche legen (besonders der 3鈥� Bereich des Primers soll spezifisch nur das Zielgen binden).
  • Das von einem Primerset amplifizierte DNA-Fragment sollte mindestens ein Intron/Exon 脺bergang beinhalten, da dann m枚gliche genomische Kontaminationen anhand Ihrer Gr枚sse identifiziert werden k枚nnen (gr枚sseres PCR-Fragment im Agarosegel).
2.  Auswahl der Primer mittels Primerdesign-Software "Primer 3":

Einlesen der cDNA Sequenz in das (im 鈥濬asta鈥� Format mit oder ohne die Kopf/Textzeile. Einf眉gen mit "Copy&Past Funktion").
Auswahl der Primerparameter/Kriterien, Software-Einstellungen:
  • Mispriming Library (repeat library): W盲hle "RODENT_AND_SIMPLE" (Was bewirkt diese Wahl?).
  • "Sequence ID": Gebe den Primersuchauftrag einen Namen (zB "Praktikum-Genname").
  • "Excluded regions": Wo soll kein Primer liegen? (Ausschluss von Homologiebereichen mit Genfamilien-Mitgliedern (MSA!).
  •  "Targets": Wo soll ein Primer liegen (in nicht-homologen Bereichen, ein Intron/Exon 脺bergang soll zwischen beiden Primern liegen.
  • "Product size range": PCR-Fragmentgr枚sse zwischen 50-100 bp f眉r real-time PCR, optimal f眉r anschliessende Gelelektrophorese: 250-600 bp. (Warum unterschiedlich?)
  • "Primer Size" (= L盲nge): 20 Nukleotide, "Primer Tm" (Annealing-Temperatur): 59.7-60.3, Optimum: 60.0 oC, "GC-Content": 40-60%, Optimum: 50%, "number to return": 20 forward/reverse. (Was bestimmt der jeweilige Parameter?)
  • Welche Einstellungen k枚nnen noch ge盲ndert werden? Welche Auswirkungen haben diese auf die Primerauswahl?
  • Auswahl eines geeigneten Primerpaars aus allen von der Software ausgegebenen Primer-Liste
          
4.  脺berp眉fung der Primer-Spezifit盲t:

Um sicherzustellen, dass die Primer nur spezifisch die gew眉nschte Gensequenz binden und amplifizieren, werden die ausgew盲hlten Primer (F/R)  mit einer Datenbank verglichen, die alle zur Zeit identifizierten Gensequenzen enth盲lt: Blast-Search.
  • W盲hle beim (s.u.) 鈥淪earch for short, nearly exact matches鈥�:
  • Einlesen mit "Copy & Paste", Leserichtung/Orientierung egal. Pr眉fen von jeweils einer Primersequenz pro search (NICHT beide auf einmal einlesen).
  • F眉r das Praktikum: Suchen Sie im Blast-Ergebnis nur nach anderen definierten Maus- oder Rattengenen, an die der Primer bindet, undefinierten Clone oder Gewebesequenzen bitte ausser Acht lassen.
  • Insbesondere die letzten 5 Basen am 3'-Ende des Primers bestimmen die Spezifit盲t (da hier die Taq-Polymerase binden muss f眉r PCR Amplifikation). Hier ist eine hohe Spezifit盲t besonders wichtig.
  • Ergeben sich hohe Homologien auch mit anderen Genen derselben Spezies, so ist der Primer nicht geeignet (Warum?). Das Absch盲tzen erfordert 脺bung - es gibt keine absoluten Regeln/Kriterien.

      Datenbanken zur Primerauswahl:

       
      Einkopieren der cDNA-Gensequenz im Fasta-Format, Einstellungen: siehe oben


      W盲hle: 鈥淪earch for short, nearly exact matches鈥�. Einschr盲nkung fuer Organism (Species) "Mus musculus" (Maus): Einkopieren jeweils einer der zu  眉berpr眉fenden Primersequenz.